Logowanie

Legislacja ROK 2006 NR 182 POZ 1 - Strona 11

Tytuł:

Dyrektywa Komisji 2006/56/WE z dnia 12 czerwca 2006 r. zmieniająca załączniki do dyrektywy Rady 93/85/EWG w sprawie zwalczania bakteriozy pierścieniowej ziemniaka

Data ogłoszenia:2006-07-04


Treść dokumentu: Legislacja ROK 2006 NR 182 POZ 1 - Strona 11

Strona 11 z 26

5.3.2.

5.3.3.

5.3.4.

5.3.5. 5.3.6.

ii)

6.

TEST PCR

Zasady Kiedy test PCR jest stosowany jako główny test przesiewowy i daje wynik dodatni, należy przeprowadzić test IF jako drugi, obowiązkowy test przesiewowy. Kiedy test PCR jest stosowany jako drugi test przesiewowy i daje wynik dodatni, do ukończenia diagnozowania konieczne jest przeprowadzenie dalszych testów, zgodnie ze schematem blokowym. Pełne wykorzystanie tej metody jako głównego testu przesiewowego jest zalecane, tylko w przypadku, gdy uzyskano ekspertyzę specjalistyczną.


L 182/18

PL Uwaga:

Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej

4.7.2006

Wstępne testy przy zastosowaniu tej metody powinny pozwolić na powtarzalne wykrywanie od 103 do 104 komórek C. m. subsp. sepedonicus na ml dodanych do ekstraktów prób, które we wcześniejszych testach okazały się ujemne. Mogą być wymagane eksperymenty optymalizacyjne, aby we wszystkich laboratoriach osiągnąć maksymalny poziom czułości i specyficzności. Stosować zatwierdzone odczynniki do procedury PCR. Najlepiej wybrać metodę z kontrolą wewnętrzną. Stosować właściwe środki ostrożności, aby uniknąć kontaminacji próby docelowym DNA. Test PCR powinien być przeprowadzony przez doświadczonych techników, w przeznaczonych do tego laboratoriach biologii molekularnej, aby możliwość kontaminacji docelowym DNA była jak najmniejsza.

Kontrole negatywne (ekstrakcja DNA i metoda PCR) należy zawsze przeprowadzać jako ostatnie próby w procedurze, aby upewnić się, czy nie nastąpiło jakiekolwiek przeniesienie DNA. W teście PCR powinny się znaleźć następujące kontrole negatywne: — — — Ekstrakt próby, która wcześniej okazała się w testach ujemna pod względem C. m. subsp. sepedonicus. Bufory kontrolne stosowane do ekstrakcji bakterii i DNA z próby. Mieszanina do reakcji PCR.

Należy uwzględnić następujące kontrole pozytywne: — — Zawiesiny osadów, do których dodano C. m. subsp. sepedonicus (przygotowanie, patrz: dodatek 2). Zawiesina 106 komórek na ml C. m. subsp. sepedonicus w wodzie z wirulentnym izolatem (np. NCPPB 2140 lub NCPPB 4053). Jeśli to możliwe, przeprowadzając test PCR korzystać także z ekstraktu DNA z kontroli pozytywnych.

Aby uniknąć potencjalnej kontaminacji, przygotowywać kontrole dodatnie w miejscu odizolowanym od prób, które mają zostać poddane testom. Ekstrakty stanowiące próby powinny być jak najdokładniej oczyszczone z ziemi. Być może w niektórych przypadkach godne polecenia byłoby przygotowanie ekstraktów z umytych ziemniaków, jeśli mają zostać zastosowane procedury PCR.

6.1.

Metody oczyszczania DNA Stosować kontrolę pozytywną i negatywną, jak opisano powyżej. Przygotować materiał kontrolny w sposób identyczny jak próbę(-y). Istnieje wiele metod oczyszczania docelowego DNA ze złożonych substratów próby, a zarazem usuwania inhibitorów PCR i innych reakcji enzymatycznych oraz koncentracji docelowego DNA w ekstrakcie z próby. Metoda przedstawiona poniżej została zoptymalizowana do użytku z zatwierdzoną metodą PCR przedstawioną w dodatku 6.

6.1.a)

Metoda według Pastrika (2000) 1. Wkroplić 220 µl roztworu buforowego do lizy (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA [pH 8,0]) do 1,5 ml probówki Eppendorfa. Dodać 100 µl ekstraktu próby i umieścić na 10 minut w bloku grzejnym lub w łaźni wodnej w 95 °C. Umieścić probówkę na lodzie na 5 minut. Dodać 80 µl roztworu lizozymu (50 mg lizozymu na ml w 10 mM Tris HCl, pH 8,0) i inkubować przez 30 minut w 37 °C. Dodać 220 µl roztworu Easy DNA® solution A (Invitrogen), wymieszać dobrze za pomocą worteksu i przez 30 minut inkubować w 65 °C.

2. 3. 4.

5.

4.7.2006

PL 6.

Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej

Dodać 100 µl roztworu Easy DNA® solution B (Invitrogen), energicznie mieszać, dopóki osad nie zacznie swobodnie przemieszczać się w probówce, a próba stanie się jednolicie kleista. Dodać 500 µl chloroformu i mieszać, dopóki lepkość nie zmniejszy się, a mieszanina nie stanie się homogeniczna. Wirować przez 20 minut przy 15 000 g w temperaturze 4 °C, aby rozdzielić fazy i utworzyć interfazę. Przenieść górną fazę do nowej probówki Eppendorfa.

< >

pobierz plik

© Unia Europejska, http://eur-lex.europa.eu/

Za autentyczne uważa się wyłącznie przepisy prawne Unii Europejskiej opublikowane w papierowych wydaniach Dziennika Urzędowego Unii Europejskiej.




Legislacja ROK 2006 NR 182 POZ 1 - Strona 11 - pozostałe dokumenty


zamów dokument

Informujemy, iż zgodnie z przepisem art. 25 ust. 1 pkt. 1 lit. b ustawy z dnia 4 lutego 1994 roku o prawie autorskim i prawach pokrewnych (tekst jednolity: Dz. U. 2006 r. Nr 90 poz. 631), dalsze rozpowszechnianie artykułów i porad prawnych publikowanych w niniejszym serwisie jest zabronione.