Logowanie

Legislacja ROK 2006 NR 182 POZ 1 - Strona 12

Tytuł:

Dyrektywa Komisji 2006/56/WE z dnia 12 czerwca 2006 r. zmieniająca załączniki do dyrektywy Rady 93/85/EWG w sprawie zwalczania bakteriozy pierścieniowej ziemniaka

Data ogłoszenia:2006-07-04


Treść dokumentu: Legislacja ROK 2006 NR 182 POZ 1 - Strona 12

Strona 12 z 26

L 182/19

7.

8. 9.

10. Dodać 1 ml 100 % etanolu (– 20 °C), przez krótką chwilę mieszać i inkubować na lodzie przez 10 minut. 11. Wirować przez 20 minut przy 15 000 g w temp. 4 °C i usunąć etanol z osadu. 12. Dodać 500 µl 80 % etanolu (– 20 °C) i zamieszać przez odwrócenie probówki. 13. Wirować przez 10 minut przy 15 000 g w temp. 4 °C, zachować osad i usunąć etanol. 14. Pozwolić, aby osad wysechł na powietrzu lub w wirówce próżniowej DNA. 15. Zawiesić osad w 100 µl sterylnej UPW i pozostawić w temperaturze pokojowej co najmniej na 20 minut. 16. Przechowywać w temp. – 20 °C do momentu, kiedy będzie potrzebny do PCR. 17. Oddzielić cały biały precypitat przez wirowanie i użyć do PCR 5 µl supernatantu zawierającego DNA. 6.1.b) Inne metody Można zastosować inne metody ekstrakcji DNA (np. Qiagen DNeasy Plant Kit), pod warunkiem że wykazano, iż są one równie skuteczne w oczyszczaniu DNA pochodzącego z prób kontrolnych zawierających od 103 do 104 komórek patogenu na ml.


6.2. 6.2.1.

PCR Przygotować matryce testowe i kontrolne do PCR zgodnie z zatwierdzoną procedurą (dodatek 6). Przygotować jedno dziesięciokrotne rozcieńczenie ekstraktu próby DNA (1:10 w UPW). Przygotować odpowiednią mieszaninę reakcyjną PCR w nieskażonym środowisku, zgodnie z ustaloną procedurą (dodatek 6). Zatwierdzona procedura PCR jest złożoną reakcją, która obejmuje także wewnętrzną kontrolę PCR. Dodać 5 µl ekstraktu DNA na 25 µl mieszaniny reakcyjnej PCR w sterylnych probówkach PCR. Dołączyć kontrolę negatywną zawierającą tylko mieszaninę reakcyjną PCR i dodać tę samą UPW, która była używana w mieszaninie PCR zamiast próby. Umieścić probówki w tym samym termocyklerze, który był używany w badaniu wstępnym, i uruchomić odpowiednio skonfigurowany program PCR (dodatek 6).

6.2.2.

6.2.3. 6.2.4.

6.2.5.

6.3. 6.3.1.

Analiza produktu PCR Rozdzielić amplikony PCR metodą elektroforezy na żelu agarozowym. Użyć co najmniej 12 µl mieszaniny reakcyjnej amplifikowanego DNA z każdej próby, zmieszanego z 3 µl buforu obciążającego (dodatek 6) w 2,0 % (masa/obj.) żelu agarozowym w buforze tris-acetate-EDTA (TAE) (dodatek 6) przy 5–8 V na cm. Stosować odpowiedni marker DNA, np. 100 bp ladder. Uwidocznić prążki DNA przez barwienie w bromku etydyny (0,5 mg na L) przez 30–45 min, stosując odpowiednie środki ostrożności przy obchodzeniu się z tym mutagenem. Oglądać zabarwiony żel w transiluminatorze UV przy małej długości fal (np. λ = 302 nm), szukając zamplifikowanych produktów PCR o oczekiwanej wielkości (dodatek 6), i udokumentować wyniki.

6.3.2.

6.3.3.

L 182/20

6.3.4.

PL

Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej

4.7.2006

Dla wszystkich nowych wyników/przypadków weryfikować autentyczność amplikonu PCR, przeprowadzając analizę z użyciem enzymów restrykcyjnych na próbce pozostałego zamplifikowanego DNA przez inkubację w optymalnej temperaturze i przez odpowiedni czas z właściwym enzymem i buforem (patrz dodatek 6). Rozdzielić strawione fragmenty za pomocą elektroforezy na żelu agarozowym jak wcześniej i oglądać charakterystyczny układ fragmentów strawionych przez enzymy restrykcyjne w transiluminatorze UV po uprzednim barwieniu bromkiem etydyny. Porównać z niestrawioną i strawioną kontrolą pozytywną. Interpretacja wyniku testu PCR: Test PCR daje wynik ujemny, jeśli specyficzny dla C. m. subsp. sepedonicus amplikon PCR o oczekiwanej wielkości nie zostanie wykryty w badanej próbie, ale jest wykrywany we wszystkich kontrolach pozytywnych (w przypadku wielokrotnego PCR ze specyficznymi roślinnymi starterami kontroli wewnętrznej: drugi produkt PCR o oczekiwanej wielkości musi być zamplifikowany z badaną próbą). Test PCR daje wynik dodatni, jeśli stwierdzi się obecność specyficznego dla C. m. subsp. sepedonicus o oczekiwanej wielkości i o oczekiwanym wzorze restrykcji (jeśli to wymagane) amplikonu PCR, pod warunkiem że nie jest on amplifikowany z którejkolwiek kontroli negatywnej. Wiarygodne potwierdzenie wyniku dodatniego można także uzyskać, powtarzając test z drugim zestawem starterów PCR (część 9.3). Uwaga:

< >

pobierz plik

© Unia Europejska, http://eur-lex.europa.eu/

Za autentyczne uważa się wyłącznie przepisy prawne Unii Europejskiej opublikowane w papierowych wydaniach Dziennika Urzędowego Unii Europejskiej.




Legislacja ROK 2006 NR 182 POZ 1 - Strona 12 - pozostałe dokumenty


zamów dokument

Informujemy, iż zgodnie z przepisem art. 25 ust. 1 pkt. 1 lit. b ustawy z dnia 4 lutego 1994 roku o prawie autorskim i prawach pokrewnych (tekst jednolity: Dz. U. 2006 r. Nr 90 poz. 631), dalsze rozpowszechnianie artykułów i porad prawnych publikowanych w niniejszym serwisie jest zabronione.