Logowanie

Legislacja ROK 2006 NR 182 POZ 1 - Strona 9

Tytuł:

Dyrektywa Komisji 2006/56/WE z dnia 12 czerwca 2006 r. zmieniająca załączniki do dyrektywy Rady 93/85/EWG w sprawie zwalczania bakteriozy pierścieniowej ziemniaka

Data ogłoszenia:2006-07-04


Treść dokumentu: Legislacja ROK 2006 NR 182 POZ 1 - Strona 9

Strona 9 z 26

5.1.1. 5.1.2.

Przygotować roztwór utrwalający (patrz dodatek 7). Za pomocą pipety przenieść 100 µl ekstraktu każdej próby do probówki Eppendorfa i wirować przez 8 min przy 7 000 g. Usunąć supernatant i rozpuścić osad w 500 µl utrwalacza przygotowanego < 24 godziny wcześniej. Zamieszać i inkubować do następnego dnia przy 4 °C. Alternatywnym utrwalaczem jest 96-procentowy etanol. W tym przypadku rozpuścić osad z etapu 5.1.2 w 50 µl 0,01M PB i 50 µl 96 % etanolu. Zworteksować mieszaninę i inkubować przez 30–60 minut w 4 °C.


5.1.3.

L 182/16

5.1.4. 5.1.5.

PL

Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej

4.7.2006

Wirować przez 8 minut przy 7 000 g, usunąć supernatant i zawiesić osad w 75 µl 0,01M PB (patrz: dodatek 3). Nanieść po 16 µl utrwalonych zawiesin na czyste szkiełko wielopunktowe, tak jak pokazano na rys. 3. Na szkiełko nakładać dwie różne próby, nierozcieńczone i w rozcieńczeniu1:100, używając 10 µl, aby uzyskać rozcieńczenie 1:100 (w 0,01M PB). Pozostały roztwór próby (49 µl) może być przechowywany w - 20 °C po dodaniu 1 objętości 96 % etanolu. W przypadku konieczności powtórzenia testu FISH, usunąć etanol przez wirowanie i dodać tę samą ilość 0,01M PB (zworteksować). Rysunek 3. Rozkład na szkiełku FISH Próba 1 Puste Puste Puste Próba 2

okienko 1 Próba 1

okienko 2 Puste

okienko 3 Puste

okienko 4 Puste

okienko 5 Próba 2

okienko 6

okienko 7

okienko 8

okienko 9

okienko 10

Szkiełko nakrywkowe 1 5.1.6.

Szkiełko nakrywkowe 2

Wysuszyć szkiełka na powietrzu (lub w suszarce do szkiełek przy 37 °C) i utrwalić je przez opalanie. Na tym etapie procedurę można przerwać. Hybrydyzację można kontynuować następnego dnia. Szkiełka powinny być przechowywane w suchym, pozbawionym kurzu środowisku, w temperaturze pokojowej.

5.2. 5.2.1.

Prehybrydyzacja i hybrydyzacja Przygotować roztwór lizozymowy, zawierający 10 mg lizozymu (Sigma L–6876) w 10 ml buforu (100 mM TrisHCl, 50 mM EDTA, pH 8.0). Roztwór ten może być przechowywany, ale powinien być zamrażany-odmrażany tylko raz. Pokryć każdą próbę około 50 µl roztworu lizozymowego i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie jednokrotnie zanurzyć szkiełka w wodzie demineralizowanej i wysuszyć za pomocą bibuły filtracyjnej. Inna procedura polega na naniesieniu na każde okienko 50 µl 40–400 µg ml–1 proteinazy K w buforze (20 mM Tris-HCl, 2 mM CaCl2, pH 7,4) zamiast lizozymu i inkubowaniu przez 30 minut w temp. 37 °C.

5.2.2.

Odwadniać komórki w serii rozcieńczeń etanolu 50 %, 80 % i 96 %, przez 1 minutę w każdej. Wysuszyć szkiełka na powietrzu w statywie. Przygotować wilgotną komorę do inkubacji, wykładając dno szczelnie zamykanego pojemnika bibułą lub papierem filtracyjnym nasączonym mieszaniną hybrydyzacyjną 1x (hybmix) (dodatek 7). Wstępnie inkubować pojemnik w cieplarce do hybrydyzacji co najmniej przez 10 minut w temperaturze 55 °C. Przygotować roztwór hybrydyzacyjny (dodatek 7), przeznaczając 45 µl na szkiełko, i wstępnie inkubować przez 5 minut w temperaturze 55 °C. Umieścić szkiełka na gorącej płycie do suszenia preparatów w temp. 45 °C i nałożyć 10 µl roztworu hybrydyzacyjnego na każde z czterech okienek na szkiełku (szkiełkach). Nałożyć dwa szkiełka nakrywkowe (24 × 24 mm) na każde szkiełko podstawowe, starając się, aby nie uwięzić powietrza. Umieścić szkiełka we wstępnie ogrzanej wilgotnej komorze i poddawać hybrydyzacji do następnego dnia, w ciemności i w temperaturze 55 °C. Przygotować trzy zlewki zawierające 1 l ultraczystej wody (UPW), 1 l 1x mieszaniny hybmix (334 ml 3x hybmix i 666 ml UPW) oraz 1 l 1/2x hybmix (167 ml 3x hybmix i 833 ml UPW). Inkubować wstępnie wszystkie w łaźni wodnej, w temperaturze 55 °C. Zdjąć szkiełka nakrywkowe z podstawowych i umieścić szkiełka podstawowe w statywie. Pozbyć się nadmiaru sondy przez inkubację przez 15 minut w zlewce z 1x roztworem hybmix temperaturze 55 °C.

< >

pobierz plik

© Unia Europejska, http://eur-lex.europa.eu/

Za autentyczne uważa się wyłącznie przepisy prawne Unii Europejskiej opublikowane w papierowych wydaniach Dziennika Urzędowego Unii Europejskiej.




Legislacja ROK 2006 NR 182 POZ 1 - Strona 9 - pozostałe dokumenty


zamów dokument

Informujemy, iż zgodnie z przepisem art. 25 ust. 1 pkt. 1 lit. b ustawy z dnia 4 lutego 1994 roku o prawie autorskim i prawach pokrewnych (tekst jednolity: Dz. U. 2006 r. Nr 90 poz. 631), dalsze rozpowszechnianie artykułów i porad prawnych publikowanych w niniejszym serwisie jest zabronione.