Logowanie

Legislacja ROK 2010 NR 73 POZ 1 - Strona 21

Tytuł:

Rozporządzenie Komisji (UE) nr 206/2010 z dnia 12 marca 2010 r. ustanawiające wykazy krajów trzecich, ich terytoriów lub części, upoważnionych do wprowadzania do Unii Europejskiej niektórych zwierząt oraz świeżego mięsa, a także wymogi dotyczące świadectw weterynaryjnych (1)

Data ogłoszenia:2010-03-20


Treść dokumentu: Legislacja ROK 2010 NR 73 POZ 1 - Strona 21

Strona 21 z 33

Mieszanina surowicy i wirusa jest następnie inkubowana w tempera­ turze 37 °C przez godzinę w  celu neutralizacji, po czym do każdej studzienki dodawa­ nych jest 0,05 ml zawiesiny o  gęstości 0,5-1,0 ×  106 komórek/ml podłoża hodowli komórkowej z dodatkiem surowicy wolnej od przeciwciał przeciw wirusowi pryszczycy i płytki się zakrywa. Płytki inkubuje się w temperaturze 37 °C. Jednowarstwową hodowlę w pełni pokrywającą powierzchnię uzyskuje się zwykle po 24 godzinach. CPE jest zwyk­ le wystarczająco dobrze widoczny po 48 godzinach. Można wówczas odczytać wynik neutralizacji pod mikroskopem lub utrwalić płytki i  wybarwić, na przykład używając 10 % mieszaniny roztworu formaliny i  roztworu soli fizjologicznej i  0,05 % roztworu błękitu metylenowego, i ocenić wynik makroskopowo. Kontrole: Kontrole do każdego testu stanowią: homologiczna antysurowica o znanym mianie, kon­ trolna hodowla komórkowa, kontrolna surowica o  znanej toksyczności, podłoże kon­ trolne oraz miareczkowanie wirusa, na podstawie którego wyliczana jest rzeczywista dawka wirusa użyta w tym badaniu. Studzienki z hodowlą, w której widoczny jest CPE, uważa się za zakażone i miano neutra­ Interpretacja: lizacyjne wyrażane jest jako odwrotność końcowego rozcieńczenia surowicy w miesza­ ninie surowicy i wirusa jako 50 % punkt końcowy ustalony zgodnie z metodą SpearmanaKärbera. (Kärber, G., Archiv für Experimentelle Pathologie und Pharmakologie, 1931, str. 162, 480.) Test jest uznawany za wiarygodny, jeżeli dawka wirusa przypadająca na jedną studzienkę waha się między 101,5 a  102,5 TCID50, a  miano surowicy wzorcowej za­ wiera się w  zakresie dwukrotnego spodziewanego miana, ustalonego na podstawie po­ przedniego miareczkowania. Jeżeli kontrole nie spełniają tych warunków, odczyny należy powtórzyć. Punkt końcowy miana 1:11 lub niższy jest uważany za wynik ujemny. (C) Wykrywanie i  oznaczanie ilościowe przeciwciał metodą ELISA przeprowadzane są zgodnie z  następującym protokołem: Antysurowice królicze przeciwko antygenowi 146S, występującemu u siedmiu typów wi­ Odczynniki: rusa pryszczycy, w  ustalonym wcześniej optymalnym rozcieńczeniu w  buforze węglanowo-dwuwęglanowym o  pH 9,6. Antygeny są przygotowywane z  wybranych szczepów wirusa namnażanego w jednowarstwowych komórkach linii BHK-21. Używa się nieoczyszczonych supernatantów hodowli wstępnie mianowanych, zgodnie z proto­ kołem, ale bez dodatku surowicy, tak aby po uzupełnieniu równą objętością PBST (roz­ twór soli fizjologicznej buforowany fosforanami, zawierający 0,05 % roztwór Tween-20 i czerwień fenolową) otrzymać rozcieńczenie o optymalnej gęstości optycznej między 1,2 a  1,5. Można też używać inaktywowanych wirusów. PBST używany jest jako rozcień­ czalnik. Antysurowice świnki morskiej przygotowuje się zakażając świnki morskie anty­ genem 146S każdego serotypu. Wstępne optymalne stężenie przygotowuje się w  PBST zawierającym 10 % normalnej surowicy bydlęcej i  5 % normalnej surowicy króliczej. Antyglobulina królicza przeciwko IgG świnki morskiej znakowana peroksydazą chrza­ nową jest używana we wstępnym optymalnym rozcieńczeniu w  PBST, zawierającym 10 % normalnej surowicy bydlęcej i 5 % normalnej surowicy króliczej. Surowice badane należy rozcieńczyć w PBST. Procedura: 1. 2. Pokryć płytki ELISA 50μl króliczej antysurowicy przeciwwirusowej oraz pozostawić je na noc w  komorze wil­ gotnościowej w temperaturze pokojowej. 50 μl serii zduplikowanych, dwukrotnie wzrastających rozcieńczeń każdej surowicy badanej, poczynając od roz­ cieńczenia 1:4, umieścić w U-dennych płytkach wielostudzienkowych (płytki nośnikowe). 50 μl stałej dawki an­ tygenu dodać do każdej studzienki i pozostawić mieszaninę na noc w  temperaturze 4 °C. Po dodaniu antygenu wstępne rozcieńczenie surowicy zmniejsza się do 1:8.


< >

pobierz plik

© Unia Europejska, http://eur-lex.europa.eu/

Za autentyczne uważa się wyłącznie przepisy prawne Unii Europejskiej opublikowane w papierowych wydaniach Dziennika Urzędowego Unii Europejskiej.




Legislacja ROK 2010 NR 73 POZ 1 - Strona 21 - pozostałe dokumenty


zamów dokument

Śledź najnowsze informacje


Informujemy, iż zgodnie z przepisem art. 25 ust. 1 pkt. 1 lit. b ustawy z dnia 4 lutego 1994 roku o prawie autorskim i prawach pokrewnych (tekst jednolity: Dz. U. 2006 r. Nr 90 poz. 631), dalsze rozpowszechnianie artykułów i porad prawnych publikowanych w niniejszym serwisie jest zabronione.